毛細(xì)管電泳法PPT介紹

石油人在北京

第22章  毛細(xì)管電泳法Capillary Electrophoresis,  CE

毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場力的驅(qū)動下，在毛細(xì)管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳。

  20世紀(jì)30－40年代                 蒂塞利烏斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)                             獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎
第22章  毛細(xì)管電泳法(Capillary Electrophoresis,  CE)
1   毛細(xì)管電泳的原理
2   分離模式
3   進(jìn)樣與檢測
4   毛細(xì)管電泳的應(yīng)用

第22章  毛細(xì)管電泳22－1   毛細(xì)管電泳的原理
1 裝置
                   毛細(xì)管                   數(shù)據(jù)處理

     電極                          檢測器
                                              電極
                       試樣
        緩沖液                                                                            緩沖液

                                                 高壓電源
                                              （可高至30KV）
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電泳
是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現(xiàn)象。
電滲
是指在電場作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。  
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電泳
行為與特性使用淌度描述  即單位場強(qiáng)(E)下離子的平均電泳速度υ
       μep=υ/E
實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)生電泳時有效淌度
        μef =υef ﹒ (L /V) =( l / tm )﹒(L /V)

       毛細(xì)管有效長度      遷移時間
                       毛細(xì)管總長度    電壓
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲
與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系

在毛細(xì)管壁雙電層的擴(kuò)散層中的陽離子，相對于毛細(xì)管壁的負(fù)電荷表面，形成一個圓筒形的陽離子鞘，在電場作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與緊密層作相對運(yùn)動，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmotic flow ,EOF）。

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的流型特點(diǎn)



電滲流                 HPLC
塞流                   層流
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的表示
電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示
  μeo =υeo / E = l /( teo﹒E )

電滲流速度  毛細(xì)管有效長度
                   電滲流流出時間  電場強(qiáng)度
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的意義
電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象
電滲流的速度比電泳速度快5－7倍
利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時完成正、負(fù)離子的分離分析
電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)
控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理2  電泳和電滲
改變電滲流的方法

改變外加徑向電場
改變緩沖液成分和濃度       Zeta電勢
改變緩沖液pH
加入添加劑
改變溫度                                   粘度
表觀電泳淌度 μap
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理3  分離效率和分離度
分離效率
柱效可以用理論塔板數(shù)n表示
            n = (μep+μeo) V l /(2DL)
                毛細(xì)管電泳分離的柱效方程
理論塔板高
           H =L / n                                               
       n = 5.54(χ/ W½)2     實(shí)驗(yàn)上可按上式求出理論塔板數(shù)
χ為電泳圖上從起點(diǎn)至電泳峰最大值之間的距離
   W½為電泳峰的半高峰寬  
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理3  分離效率和分離度
分離度
電泳中兩峰的分離度（Rs），也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組分分開的能力，可表達(dá)為
           Rs= （n 1/2/4）×（ Δυ /υ平 ）
Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差
υ平為兩者的平均速度
Δυ / υ平表示分離選擇性
n為柱效

分離度計(jì)算式

Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 )

tm1、tm2   分別為兩個組份的遷移時間
W     為峰底的寬度

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理4  區(qū)帶寬度及其展寬因素
區(qū)帶寬度

       Ws =（Wt﹒l/tm）-Wd

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－1  毛細(xì)管電泳的原理4  區(qū)帶寬度及其展寬因素
區(qū)帶寬度展寬因素
焦耳熱
進(jìn)樣
電泳擴(kuò)散
毛細(xì)管壁對組分的吸附


焦耳熱   





       細(xì)內(nèi)徑（<100μm），粗外徑的毛細(xì)管柱

進(jìn)樣
              試樣導(dǎo)入毛細(xì)管柱時，總有一定的試樣區(qū)帶長度。
          細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管柱時，進(jìn)樣操作的要求更為嚴(yán)格。
                                      一般進(jìn)樣區(qū)帶控制在柱長的1%

電泳擴(kuò)散            
               試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻率不相等時，因兩個區(qū)域電場強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶電分散。
                        μs---μb


毛細(xì)管壁對組分的吸附  
      電泳峰拖尾或變形，甚至消失。
抑制吸附作用常用的方法有：
●使用極端pH條件
●加入中性鹽或兩性離子化合物
●對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理
    需要注意：方法也會抑制或改變電滲流
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                        22－2  分離模式
1  毛細(xì)管區(qū)帶電泳
2  膠束電動色譜
3  毛細(xì)管凝膠電泳
4  毛細(xì)管等速電泳
5  毛細(xì)管等電聚焦
6  毛細(xì)管電色譜

第二十二章  毛細(xì)管電泳                                                                                 22－2  分離模式1  毛細(xì)管區(qū)帶電泳
CZE   也稱為毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳
毛細(xì)管電泳中最基本的操作模式，應(yīng)用最廣泛，是其它各種操作模式的母體
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                         22－2  分離模式2  膠束電動色譜
          電動色譜:是以電滲流驅(qū)動的一種色譜技術(shù)
膠束電動色譜  MEKC:是以膠束為假固定相的一種電動色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的結(jié)合

膠束電動色譜的應(yīng)用特點(diǎn):
使毛細(xì)管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.
比高效液相色譜更為高效.
    HPLC 分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/m
    MEKC 可達(dá)到50000－500000理論板數(shù)/m
比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時間通常小于30min，但達(dá)到相仿效率的毛細(xì)管LC，需要更長的時間。

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                 22－2  分離模式3  毛細(xì)管凝膠電泳
CGE 是毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式
    用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離

毛細(xì)管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn) :
電泳峰尖銳，柱效極高
短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離
試樣容量為10－12g
主要缺點(diǎn):制備柱較困難，壽命較短
已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核  酸、DNA等強(qiáng)有力的工具。例應(yīng)用CGE分離與激光誘導(dǎo)熒光檢測相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                             22－2  分離模式   4  毛細(xì)管等速電泳
分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進(jìn)樣前后分別使用前導(dǎo)電解質(zhì)溶液和終結(jié)電解質(zhì)溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過檢測窗口。


注意:
前導(dǎo)電解質(zhì)的電泳淌度應(yīng)高于試樣中各組分的電泳淌度，而終結(jié)電解質(zhì)的電泳淌度則反之。
電泳過程中被分離各組分的濃度都將接近前導(dǎo)電解質(zhì)濃度，對痕量組分在柱上濃縮可達(dá)幾個數(shù)量級，成為重要的柱上濃縮技術(shù)之一。

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                           22－2  分離模式5  毛細(xì)管等電聚焦
CIEF:
     建立在不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點(diǎn)（pI值）差異基礎(chǔ)上的分離方法。
蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI):
    指蛋白質(zhì)分子的表觀電荷數(shù)為零時的pH值。

方法:       進(jìn)樣－等電聚焦－檢測
先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進(jìn)樣充入毛細(xì)管柱(陽極端)，置于陽極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。
施加電壓，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時會在其等電點(diǎn)的pH區(qū)域內(nèi)停止移動。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會在毛細(xì)管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.
在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。

特點(diǎn):
等電聚焦實(shí)際上也是一個試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。
具有極高的分辯率，可以分離等電點(diǎn)相差0.01pH的兩種蛋白質(zhì).

注意:電滲流的存在會破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                           22－2  分離模式6  毛細(xì)管電色譜
CEC:以電滲流驅(qū)動流動相，
      開管和填充兩種

比高效液相色譜具有更高的柱效  
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                               22－3   進(jìn)樣與檢測
1  進(jìn)樣方法
電動進(jìn)樣  也稱電遷移進(jìn)樣.
   方法:將毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測端的緩沖液間施加進(jìn)樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進(jìn)入毛細(xì)管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進(jìn)行。
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                        22－3   進(jìn)樣與檢測 1  進(jìn)樣方法
流體動力學(xué)進(jìn)樣
           也稱為虹吸進(jìn)樣、重力進(jìn)樣、壓差進(jìn)樣
方法:毛細(xì)管進(jìn)樣端插入試樣溶液容器，通過進(jìn)樣端加壓，或檢測端出口減壓，或調(diào)節(jié)進(jìn)樣端試樣溶液液面大于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，使進(jìn)樣口端與出口端形成正壓差，并維持一定時間，試樣在壓差作用下進(jìn)入毛細(xì)管進(jìn)樣端，再把進(jìn)樣端放回緩沖液液槽中，進(jìn)行電泳  
第22章  毛細(xì)管電泳                                                                                  22－3   進(jìn)樣與檢測 2  檢測方法


第二十二章  毛細(xì)管電泳                                                                           22－3   進(jìn)樣與檢測 2  檢測方法
檢測器                      檢出限（mol/L）                   特    點(diǎn)

UV－可見吸收                     10-5－10-6                近似通用，常規(guī)應(yīng)用
熒光
       非相干光誘導(dǎo)              10-7－10-8               靈敏，但試樣通常要衍生
         激光誘導(dǎo)                      10-10－10-12           高靈敏度，價格昂貴，要衍生化
電化學(xué)
    電導(dǎo)                              10-5－10-7                  通用性
        安培                               10-8－10-9               選擇性，靈敏度高，微量

質(zhì)譜                                     10-7－10-9              儀器復(fù)雜，可獲結(jié)構(gòu)信息，
                                                                                       質(zhì)量靈敏度高

放射                                      10-9－10-11               靈敏度高，操作有特殊要求

第22章  毛細(xì)管電泳                                                                             22－4  應(yīng)用
陣列毛細(xì)管凝膠電泳分析DNA序列

           硬件由十六條毛細(xì)管組成陣列         用氬激光激發(fā)熒光檢測
               CCD檢測器接收熒光

     可以進(jìn)行連續(xù)地大規(guī)模地基因測量
 《毛細(xì)管電泳法》結(jié)束

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